1. 絕大部分細(xì)胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可.吸去胰酶后,殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞.對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞,連續(xù)這樣傳代,對細(xì)胞傷害很大.簡單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后37℃消化.比較難消化的細(xì)胞(潤洗方法5min還不能消化),這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育.

    2.細(xì)胞如何算是消化好了呢?不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層,只要能移動了,多半呈沙壯移動,其實已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成*分離細(xì)胞,這是沒有必要的.一般能移動了,說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了,細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了(雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布).這個時候應(yīng)該停止消化,不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好,間隙很大,才停止.細(xì)胞就是*成單個細(xì)胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會聚集,這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性.如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致,那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至*吹打成單細(xì)胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細(xì)胞的特性,是因為貼壁過程中重新聚集了.這個時候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細(xì)胞之后會對你越來越不好.

    3.EDTA的作用.胰酶切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白,而EDTA通過螯合Ca離子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加溫和.有的人在胰酶里添加一些EDTA,或者對付特別難消化的細(xì)胞,添加多一些EDTA.

    4.PBS洗滌.消化之前用PBS洗滌,是常見的操作,因為血清中含有抑制胰酶的蛋白.對于一些難消化細(xì)胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因為這些離子也會抑制胰酶的活性.但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞,不需要配制如此溶液.